Analisis Protein

protein

Penentuan protein total dapat dilakukan secara empiris (tidak langsung) melalui penentuan jumlah kandungan N dan cara absolute (langsung) melalui pemisahan,
pemurnian, dan penimbangan. Cara absolute sangat sulit, butuh waktu yang lama dan mahal hanya untuk keperluan tertentu.

C.1  Penentuan dengan Cara Kjeldahl

Cara ini dilakukan dalam 3 tahapan :

1.      Tahap destruksi

Destruksi merupakan proses dekomposisi senyawa organik dan memisahkan / melarutkan senyawa anorganik. Destruksi dilakukan dengan memanaskan sampel dalam asam sulfat pekat untuk mendestruksi protein menjadi usnsur-unsurnya. Proses destruksi dipercepat dengan menambahkan katalis campuran Na₂SO₄ dan HgO (20:1) atau K₂SO₄ dan CuSO₄ (1:1).

Reaksi yang terjadi selama proses destruksi (jika katalisnya Na₂SO₄ dan HgO).

Pada proses destruksi, nitrogen dari protein diubah menjadi (NH₄)₂SO₄   (larutan dari hitam sampai jernih)

2.      Tahap destilasi

Pada tahap ini (NH₄)₂SO₄   di pecah menjadi NH₃ dengan penambahan NaOH 1 M hingga alkalis dan pemanasan pada suhu 100-150 ^oC. NH₃ yang dihasilkan ditangkap dengan larutan HCl standar atau as. Borat 4%

3.      Tahap titrasi

Jika destilat ditampung dengan HCl 0,1 N 50 mL, maka sisa HCl yang tidak bereaksi dengan NH3 dititrasi dengan NaOH standar 0,1 N dengan indikator PP

Jika destilat ditampung dengan as. Borat 4%, maka jumlah as. Borat yang bereaksi dengan NH3 dititrasi dengan HCl standar 0,1 N dengan indikator BCG (brom kresol green) + MR (metil red)

Tabel Faktor perkalian beberapa bahan

No	Nama Bahan	Faktor Perkalian
1	Bir, sirup, biji-bijian, ragi	6,25
2	Buah-buahan, the, anggur, malt	6,25
3	Makanan ternak	6,25
4	Beras	5,95
5	Roti, gandum, macaroni, mie	5,70
6	Kacang tanah	5,46
7	Kedelai	5,75
8	Kenari	5,18
9	Susu	6,38
10	Gelatin	5,55

C.2  Penentuan Dengan Metode Lowry

Protein dengan fosfotungstat – fosfomolibdat pada suasana basa akan memberikan warna biru, dimana intensitas warna tergantung pada konsentrasi protein. Absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada λ = 600 nm. Sebagai larutan standar digunakan bovine serum albumin (BSA) dengan konsentrasi menaik.

Ø  Reagen lowry A (fosfotungstat – fosfomolibdat = 1:1)

Ø  Reagen lowry B (Na-karbonat 2% dalam NaOH 0,1 N; kupri sulfat dan Na-K-Tartarat 2%)

 Cara penentuan :

1.      Sebanyak 1 ml Protein ditambah 5 mL lowry B (digoyang dan dibiarkan ± 10 menit)

2.      Sebanyak 0,5 mL lowry A ditambahkan kedalam campuran tersebut (digoyang dan dibiarkan ± 20 menit)

3.      Larutan diukur absorbansinya pada λ = 600 nm.

4.      Konsentrasi protein ditentukan dengan memplot Abs-nya pada kurva kalibrasi standar.

C.3  Penentuaan dengan Metode Biuret

Larutan protein dibasakan dengan NaOH dan ditambahkan CuSO₄ encer. Reaksinya memberikan warna merah violet atau biru violet, dimana intensitas warna tergantung pada konsentrasi protein.

Absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer pada λ = 560 - 580 nm. Konsentrasi protein ditentukan dengan memplot nilai absorbansai pada kurva standar regresi.

C.4  Penentuan dengan Spektrometri UV

Cara ini tidak efisien dan tidak merusak bahan. Larutan sampel jernih dapat diukur langsung absorbansinya dengan spektro UV pada λ = 280 nm. Konsentrasi protein ditentukan dengan memplot nilai absorbansai pada kurva standar regresi.

C.5  Penentuan dengan titrasi Formol

Larutan protein dinetralkan dengan NaOH, lalu gugus aminonya diikat dengan penambahan formalin, sedang gugus karboksilnya ditirasi dengan NaOH standar (indikator PP). Titrasi formol hanya tepat untuk penentuan suatu proses pemecahan protein dan kurang tepat untuk penentuan protein. Reaksi titrasi formol sebagai berikut :